Isabel de Trastámara nació en Madrigal de las Altas Torres (Ávila) el 22 de abril, Jueves Santo, de 1451. Fue hija de Juan II de Castilla y de su segunda mujer, Isabel de Portugal (1428-1496). Dos años después, en Tordesillas, nacería su hermano Alfonso. Con anterioridad, y fruto del matrimonio entre Juan II de Castilla y María de Aragón, había nacido su hermanastro Enrique, que ocuparía el trono en 1454 y sería conocido como Enrique IV el Impotente.

A la muerte de su padre en 1454, se retiró con su madre y su hermano Alfonso a la villa de Arévalo, donde vería los ataques de locura de su madre Isabel. En esta adversidad Isabel se fortaleció con lecturas evangélicas y libros de piedad. También le ayudó su amistad con Santa Beatriz de Silva (1424 - 1491), a la que luego ayudaría en la fundación de la Orden de las Concepcionistas Franciscanas.

En 1461, Isabel y su hermano Alfonso son trasladados a Segovia, lugar donde se emplazaba la Corte, por estar cercano el nacimiento de la hija de los reyes, doña Juana de Castilla. Pronto, se la apodó Juana la Beltraneja pues, según los rumores de la época, era hija de la reina, doña Juana de Portugal, y de Beltrán de la Cueva.

Los nobles, ansiosos de poder, enfrentaron a su hermano Alfonso con su hermanastro el rey Enrique, deponiéndolo en la "Farsa de Ávila". En 1468, su hermano Alfonso murió, al parecer, envenenado, en Cardeñosa. En un principio, se pensó que fue víctima de la peste, pero elç médico que examinó el cadáver no encontró ningún indicio de tal enfermedad.

A pesar de las presiones de los nobles, ella rechazó proclamarse reina mientras Enrique IV estuviera vivo. Por el contrario, consiguió que su hermanastro le otorgase el título de Princesa de Asturias, en una ceremonia que tuvo lugar en los Toros de Guisando, el 19 de septiembre de 1468, conocida como la Concordia de Guisando. Se dice que don Andrés de Cabrera, tesorero real, dijo al rey: "la virtud y la modestia de la infanta nos obligan a esperar que no tendrá más voluntad que la vuestra, ni alentará la ambición de los Grandes, pues no hubiese rehusado el título de Reina que la ofrecían contentándose con el de Princesa que, a su entender, le pertenece". Isabel se constituyó así como heredera a la corona, por delante de su sobrina y ahijada de bautismo, Juana la Beltraneja, a quien no se consideraba legitimada para ocupar el trono, por las dudas que había sobre su paternidad.

A partir de este momento, Isabel pasa a residir en Ocaña, villa perteneciente a don Juan Pacheco, marqués de Villena. El rey inicia contactos diplomáticos con otras casas reales para lograr un acuerdo matrimonial que le reporte beneficios.

El matrimonio tuvo 6 hijos:

- Isabel (1 de octubre de 1470 – 1498), Princesa de Asturias (1497–1498), contrajo matrimonio con el Infante Alfonso de Portugal, pero a su muerte contrajo matrimonio con el primo del fallecido, Manuel, que sería rey de Portugal con el nombre de Manuel I, el Afortunado, murió en el parto de su hijo Miguel de Paz.
- Juan (30 de junio de 1478 – 1497), Príncipe de Asturias (1478–1497). En 1497, contrajo matrimonio con Margarita de Austria (hija del emperador germánico Maximiliano I de Habsburgo), murió de tuberculosis poco después. Tuvo un hijo póstumo que nació muerto. Margarita se fue de España y se encargó por un tiempo de su sobrino Carlos, futuro Carlos V.
- Juana la Loca (6 de noviembre de 1479 – 1555), Princesa de Asturias (1500–1504), Reina de Castilla (1504–1555) con el nombre de Juana I. En 1486, contrajo matrimonio con Felipe el Hermoso de Habsburgo (también hijo del emperador Maximiliano I). Con él entró una nueva dinastía en España, la de los Habsburgo, que formaban la Casa de Austria. En 1500, fue por segunda vez madre de su primer hijo varón, Carlos V quien la sucedería y sería también Emperador de Sacro Imperio Romano Germánico. En 1503, dio a luz a Fernando, sucesor de Carlos V y restauró la rama austríaca imperial de la Casa de los Austrias. Murió recluida por su hijo Carlos en Tordesillas.
- María (29 de junio de 1482 – 1517), contrajo matrimonio en 1500 con el viudo de su hermana Manuel I de Portugal, el Afortunado. Fue madre de diez hijos, entre ellos: Juan III, Enrique I de Portugal y la Emperatriz Isabel, esposa de Carlos V.
- Catalina (12 de diciembre de 1485 – 1536), contrajo matrimonio con el príncipe Arturo de Gales en 1502, que murió pocos meses después de la boda. En 1509 se desposó con el hermano de su difunto marido, que sería Enrique VIII, por lo tanto se convirtió en reina de Inglaterra, fue madre de la reina María I de Inglaterra, María Tudor.
- Pedro de Embasaguas (1488 – 1490), el «Infante», falleció a poco de nacido.

Llegó al trono tras vencer en la Guerra de Sucesión Castellana (1475-1480), enfrentándose con los partidarios de su sobrina Juana.

Isabel se proclama Reina de Castilla el 13 de diciembre de 1474 en Segovia, tomando como base el Tratado de los Toros de Guisando. Desde el Alcázar de Segovia se dirigió a la Iglesia de San Miguel, contigua a la plaza mayor. Tras jurar por Dios, por la Cruz y por los Evangelios, que sería obediente a los mandamientos de la Santa Iglesia, le juraron lealtad. Luego, entró en el interior del templo, portando el pendón de Castilla y abrazada a sus pliegues.

Fue una mujer de mucho carácter y con mucha decisión propia. Con sus hijos fue severa, pero buena madre, haciéndoles entender que tenían unas obligaciones por su rango de hijos de reyes, y que debían sacrificarse mucho por ese motivo.

Creyó en los proyectos de Cristóbal Colón y a pesar de las muchas críticas y reacciones políticas adversas de la corte y los científicos; una leyenda dice que financió con sus joyas el viaje que llevaría al descubrimiento de América. Realmente fue un grupo de mercaderes, los mismos que financiaron la visita de Fernando de Aragón para casarla. Durante el reinado común con Fernando se produjeron hechos de gran trascendencia para el futuro del reino como el establecimiento de la Santa Inquisición (1480), la creación de la Santa Hermandad, la incorporación del Reino nazarí de Granada, así como la unificación religiosa de la Corona Hispánica, basada en la conversión obligada de los judíos, so pena de expulsión (Edicto de Granada, 1492) y más tarde de los musulmanes. Por último, la anexión de Navarra (1512), (ya muerta la reina) significó el origen del futuro Reino de las Españas.

Recluida en Medina del Campo, cuando enfermó de un cáncer de útero que la llevó a la tumba, mandó que las misas por su salud se tornaran por su alma, bien segura de próximo fin. Consciente pidió la Unción de los Enfermos y el Santísimo Sacramento, que recibió con singular piedad.

Tras su fallecimiento, un poco antes del mediodía del 26 de noviembre de 1504 en el Palacio Real de Medina del Campo (Valladolid), su esposo accedió al trono de Castilla reinando bajo el nombre de Fernando II de Aragón y V de Castilla.

Primeramente fue inhumada en San Francisco de la Alhambra, el 18 de diciembre de 1504, en una sencilla sepultura según su deseo. Actualmente Isabel I está enterrada en la Capilla Real de Granada en un fastuoso sepulcro construido por su nieto, Carlos I (que fue profanado durante la Invasión Francesa), junto a su marido Fernando el Católico, su hija Juana I y el marido de ésta Felipe I. También se enterró allí su nieto Miguel, que falleció a los 2 años de edad, hijo del rey Manuel I de Portugal y su hija Isabel. En el museo de la Capilla Real, se encuentra la corona y el cetro de la reina.